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pcr短期存放方法

来源:网络 作者:网友上传 时间:07-01 手机版

1、PCR样本可分2种,DNA样本和RNA样本。

2、DNA样本:已经提取好的DNA样本,负80度保存,干冰运输;血液样本,需全血,加入抗凝剂,抗凝管4度保存;组织样本,需冻存管或干净灭菌的离心管装,负80度保存,干冰运输;细胞样本,用胰酶消化后的细胞沉淀,负20度或负80度保存。

3、RNA样本:提取好的RNA样本,负80度保存,干冰运输;血液样本,全血,加入抗凝剂,4度冰箱保存;组织样本,冻存管或干净灭菌离心管,负80度保存,干冰运输;细胞样本,用胰酶消化后的细胞沉淀,负20度或负80度保存。长时间保存,可加Trizol,其中血液用Trizol LS 组织和细胞沉淀用Trizol。

要做PCR的血液标本如何保存

最好是用淋巴细胞分离液把单个核细胞分离出来,然后-80℃保存。

外周血单个核细胞(Peripheral?blood?mononuclear?cell,PBMC)的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque?density?gradient?centrifugation),用此方法分离PBMC纯度可达95%,淋巴细胞约占90%,其中T淋巴细胞占80%,B淋巴细胞占4~10%。ficoll-hypaque混合溶液,又称淋巴细胞分层液,在分离人PBMC时,要求其比重为1.077;分离小鼠单个核细胞时比重为1.080;分离大鼠单个核细胞时比重为1.084~1.087;分离马单个核细胞时比重为1.090。

【原理】

血液中各有形成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液(又称淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC。

【器材与试剂】

1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。

2.pH7.2?Hanks液、肝素、生理盐水溶液,淋巴细胞分层液。

【方法】

1.静脉取血2ml,加入含肝素溶液(10~50u/m1血样本)的试管中,混匀,使血液抗

凝。用pH7.2?Hanks液将抗凝血稀释1倍。

2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中,然后将离心管倾斜45O角,用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面,应注意保持两者界面清晰。

3.在18℃~20℃下,用水平离心机以2000r/min离心20min。离心后细胞分布如图。

?4.用毛细吸管轻轻插到混浊带,沿管壁轻轻吸出此层细胞,移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分。

5.用Hanks液洗涤细胞3次。第一次2000r/min?,10?min;第2~3?次1500r/min?,10?min,可去掉大部分混杂的血小板。

6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。

【注意事项】

1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时,上述操作过程都要在无菌条件下进行,所用器材、试剂都应为无菌。

2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光4℃保存。

3、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时,不得将血液冲入分离液中,须保持两层液体的清晰界面。

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